Водород действует как терапевтический антиоксидант

Авторы: Ikuroh Ohsawa1, Masahiro Ishikawa1, Kumiko Takahashi1, Megumi Watanabe1,2, Kiyomi Nishimaki1, Kumi Yamagata1, Ken-ichiro Katsura2, Yasuo Katayama2, Sadamitsu Asoh1 & Shigeo Ohta1

Острый окислительный стресс, вызванный ишемией-реперфузией или воспалением, вызывает серьезное повреждение тканей, а стойкий оксидативный стресс считается одной из причин многих распространенных заболеваний, включая рак. Мы показываем, что водород (H2) имеет потенциал в качестве антиоксиданта в профилактических и терапевтических целях. Мы индуцировали острый окислительный стресс в культивируемых клетках тремя независимыми методами. H2 избирательно восстанавливает гидроксильный радикал — наиболее цитотоксичный из активных форм кислорода (АФК, ROS) — и эффективно защищает клетки; однако H2 не реагировал с другими ROS, которые играют физиологическую роль. Мы использовали модель на крысах, в которой окислительный стресс был вызван в головном мозге очаговой ишемией и реперфузией. Вдыхание газа H2 заметно подавляло тяжесть течения травмы головного мозга, нейтрализуя эффекты окислительного стресса. Таким образом, H2 можно использовать как эффективную антиоксидантную терапию. Благодаря своей способности быстро диффундировать через мембраны, он может достигать цитотоксических АФК и реагировать с ними и, таким образом, защищать от окислительного повреждения.

Окислительный стресс возникает из-за сильного клеточного окислительного потенциала избыточных активных форм кислорода (АФК) или свободных радикалов1–5. Большая часть производимого супероксидного анион-радикала (O2۰) генерируется в митохондриях в результате утечки электронов из цепи переноса электронов и цикла Кребса6. O2۰ также продуцируется метаболическими оксидазами, включая НАДФН-оксидазу и ксантиноксидазу7. Супероксиддисмутаза превращает O2۰ в пероксид водорода (H2O2) 8, который детоксифицируется в H2O с помощью глутатионпероксидазы или каталазы. Избыток O2۰ восстанавливает ионы переходных металлов, таких как Fe3 + и Cu2 + (ссылка 2), восстановленные формы которых, в свою очередь, могут реагировать с H2O2 с образованием гидроксильных радикалов (۰OH) по реакции Фентона. ۰OH — самый сильный из окислителей и реагирует с нуклеиновыми кислотами, липидами и белками без разбора. Пока что не существует известной системы детоксикации ۰OH; следовательно, удаляя ۰OH, осуществляется важнейший антиоксидантный процесс9.

Несмотря на их цитотоксические эффекты, O2۰ и H2O2 играют важную физиологическую роль при низких концентрациях: они функционируют как регуляторные сигнальные молекулы, которые участвуют в многочисленных каскадах передачи сигналов, а также регулируют биологические процессы, такие как апоптоз, пролиферация и дифференцировка клеток7,10. При более высоких концентрациях H2O2 преобразуется миелопероксидазой в хлорноватистую кислоту; а хлорноватистая кислота защищает от бактериального вторжения5. Оксид азота (NO), еще одна АФК, действует как нейротрансмиттер и необходим для расширения кровеносных сосудов11. Таким образом, цитотоксические радикалы, такие как ۰OH, должны нейтрализоваться без ущерба для основных биологических активностей других, физиологически полезных, АФК. Здесь мы демонстрируем, что молекулярный водород (дигидроген, H2) может ослаблять цитотоксичность, индуцированную ۰OH, не влияя на другие АФК, и предполагаем, что H2 имеет потенциал в качестве антиоксиданта для профилактического и терапевтического применения.

ПОЛУЧЕННЫЕ РЕЗУЛЬТАТЫ

H2 селективно восстанавливает ۰OH в культивируемых клетках

H2 восстанавливает ۰OH, образующийся при радиолизе или фотолизе воды12, однако, может ли H2 эффективно нейтрализовать ۰OH в живых клетках — непосредственно не исследовалось. Поскольку повреждение клеток, вызванное спонтанной генерацией ۰OH, сложно исследовать, мы индуцировали продукцию O2۰ в культивируемых клетках PC12. Для этого мы обработали клетки ингибитором митохондриального респираторного комплекса III, антимицином A (ссылка 13); после такой обработки O2۰ в этих клетках быстро превращается в H2O2. Добавление антимицина A увеличивало уровни O2۰ и H2O, судя по флуоресцентному анализу.

Добавление антимицина А повышало уровни O2۰ и H2O2, о чем свидетельствуют сигналы флуоресценции, испускаемые окисленными формами MitoSOX (рис. 1a) и 2’,7’-дихлордигидрофлуоресцеина (H2DCF) (дополнительный Рис.1) соответственно. Мы растворили H2 и O2 в среде как описано в Методиках, и подтвердили длительность (24 часа) поддержания уровня H2 (дополнительный рис. 2). H2, растворенный в культуральной среде, не уменьшал сигналы MitoSOX и DCF (рис. 1а, б и дополнительный рис. 1). Кроме того, H2 не снижал установившийся уровень NO (дополнительный рисунок 1). Напротив, обработка H2 значительно снизила уровни ۰OH, как оценивается по сигналу флуоресценции, испускаемому окисленной формой 2- [6- (4’-гидрокси) фенокси-3H-ксантен-3-он-9-ил] бензоата (HPF) (ссылки 14,15 и рис. 1c, d). Когда мы поместили клетки к антимицину A (30 мг/мл) без присутствия H2, HPF сигналы увеличились как в ядерной области, так и в цитоплазме, вероятно, потому что H2O2 диффундировал из митохондрий, чтобы произвести ۰OH. Примечательно, что H2 снижает уровень ۰OH даже в ядерных областях (рис. 1в).

1 800x243

2

Рисунок 1 Молекулярный водород, растворенный в среде, селективно восстанавливает гидроксильные радикалы в культивируемых клетках. (a, b) Клетки PC12 инкубировали в среде с 0,6 мМ H2 или без него и подвергали действию антимицина A (30 мг/мл в течение 30 мин) для индукции продукции O2۰. Затем их лечили 0,5 мМ MitoSOX. Репрезентативные флуоресцентные изображения клеток, обработанных MitoSOX, были получены с помощью конфокальной микроскопии с лазерным сканированием (Olympus FV300). Флуоресценцию MitoSOX количественно оценивали для 100 клеток каждого независимого эксперимента (n=5). (c) Репрезентативные конфокальные изображения лазерного сканирования флуоресценции маркера ۰OH HPF были получены через 30 мин после добавления антимицина A. Стрелки указывают на увеличение и уменьшение, соответственно, сигналов HPF в ядерной области. (d) H Флуоресценцию HPF в клетках, обработанных антимицином А с 0,6 мМ H2 или без него, количественно оценивали по 100 клеткам (n = 4). ** P o 0,01, *** P o 0,001. (e) Через 30 минут после добавления антимицина A (10 мг/мл) с Н2 или без Н2 (0,6 мМ) клетки инкубировали с 1 мМ MTGreen и 100 нМ TMRM в течение 10 минут, а затем визуализировали. Два изображения были наложены (объединены). (f) Клетки предварительно обрабатывали 4,5 г/л 2-дезоксил-D-глюкозы (ингибитор гликолиза) и 1 мМ пирувата, и относительные клеточные уровни АТФ определяли количественно после воздействия 30 мг/мл антимицина A. Уровни АТФ в клетках не обработанные антимицином А были установлены на 100% (n ≥ 3). * Р о 0,05, ** Р о 0,01. Масштабные линейки: 100 мм в a; 50 мм в с; 20 мм в д. Гистограммы показывают среднее значение ± стандартное отклонение. 

H2 предотвращал снижение потенциала митохондриальной мембраны после обработки антимицином A, что обнаруживается по флуоресценции метилового эфира тетраметилродамина (TMRM), которая зависит от потенциала митохондриальной мембраны, тогда как уровни флуоресценции MitoTracker Green (MTGreen) не зависят от изменений мембранного потенциала (рис. 1д). Это свидетельствует о том, что H2 защищает митохондрии от ۰OH. Клетки, обработанные H2, выглядели нормально, тогда как клетки, не обработанные H2, были сморщены и имели неправильную округлую форму (рис. 1e). Наряду с этим защитным действием H2 также предотвращал снижение клеточных уровней АТФ, синтезируемого в митохондриях (рис. 1f). Тот факт, что H2 защищает митохондрии и ядерную ДНК, свидетельствует о том, что H2 проникает в большинство мембран и диффундирует в органеллы. H2, растворенный в среде, защищает культивируемые клетки от ۰OH. Мы поместили клетки PC12 в культуральную среду, содержащую H2 и O2, и в то же время вызвали окислительный стресс, добавив антимицин A. Через 24 часа после индукции ROS антимицином A мы обнаружили, что H2, по-видимому, защищает ядерную ДНК от окисления, о чем свидетельствует снижение уровня окисленного гуанина (8-OH-G) (рис. 2a, b и ссылка 16). Кроме того, H2 также снижает уровни 4-гидроксил-2-ноненаля (HNE) — конечного продукта перекисей липидов (рис. 2c, d и ссылка 17), указывая на то, что он защищает липиды от перекисного окисления. Кроме того, растворенный в среде H2 защищал клетки от гибели клеток дозозависимым образом (рис. 2e, f). Когда мы удалили H2 из среды, которая была насыщена H2, защитный эффект исчез (рис. 2f), предполагая, что наблюдаемый эффект не был вызван реакцией H2 со средой. Кроме того, мы подтвердили, что H2 защищает жизнеспособность клеток, используя два метода: модифицированный анализ MTT (анализ WST-1) и измерение утечки клеточной лактатдегидрогеназы (LDH) из поврежденных клеток (дополнительный рис. 3). Чтобы исключить возможность того, что защитный эффект H2 был обусловлен реакцией с антимицином А, мы индуцировали АФК, добавляя менадион, ингибитор, который действует на
митохондриальный комплекс I, и наблюдали, что Н2 защищает клетки в этой системе (дополнительный рис. 3).
Чтобы убедиться, что H2 защищает от ۰OH, мы предварительно обработали клетки Cu2 +, а затем подвергли их воздействию аскорбата, чтобы восстановить внутриклеточный Cu2 + до Cu +, что, в свою очередь, катализирует образование ۰OH из клеточного H2O2, который производится эндогенно. Эта обработка в первую очередь индуцировала ۰OH внутри клеток (за счет реакции Фентона), таким образом, прямо подтверждая, что Н2 защищает клетки от клеточного ۰OH (рис. 2g, h).

Спиновая ловушка определяет свободный радикал, который восстанавливается H2.
Чтобы идентифицировать виды свободных радикалов, которые восстанавливает H2, мы изучили влияние H2 на сигналы электронного парамагнитного резонанса (ЭПР) спин-ловушечных реагентов. Мы продуцировали ۰OH клеточной реакцией Фентона и полуколичественно определили клеточные уровни ۰OH с помощью спиновой ловушки с использованием 5,5-диметил-1-пирролин N-оксида (ДМПО). Измерения СОЭ показали, что обработка H2 действительно уменьшала сигналы ДМПО-ОН, полученные из ۰OH (рис. 3a – c). Более того, когда мы индуцировали продукцию O2۰ путем обработки клеток антимицином A в присутствии DMPO, мы наблюдали множественные сигналы ESR18. Эти сигналы, по-видимому, состоят из сигналов от радикалов ДМПО-ОН и ДМПО-Н (рис. 3d-е). Радикал DMPO-H происходит от радикала водорода (H), который может быть индуцирован порфиринами. Для визуализации сигналов, которые подавляет H2, был использован дифференциальный спектр. Мы обнаружили, что только сигналы, производные ۰OH, были снижены после обработки H2 (рис. 3e). Эти результаты убедительно свидетельствуют о селективном снижении клеточного ۰OH обработкой Н2. H2 селективно восстанавливает ۰OH и ONOO– в бесклеточных системах. Затем мы подтвердили в чистом растворе, что флуоресценция HPF может использоваться для мониторинга восстановления ۰OH H2 во время непрерывного производства ۰OH в реакции Фентона. В этом состоянии H2 подавлял увеличение сигналов HPF дозозависимым образом (рис. 4a – c). Но, когда мы смешали раствор, содержащий H2, с предварительно окисленным HPF с ۰OH, сигналы флуоресценции окисленных HPF не уменьшались (данные не показаны), подтверждая идею, что H2 напрямую реагирует с ۰OH. Затем мы исследовали реакционную способность H2 с другими ROS или химически активными формами азота (RNS). Мы приготовили H2O2 и пероксинитрит (ONOO–) путем разбавления соответствующих исходных растворов, O2- ферментативной реакцией ксантиноксидазы с ксантином, а NO — спонтанной реакцией 1-гидрокси-2-оксо-3- (N-метил-3-аминопропил)-3-метил-1-триазена (NOC7) в бесклеточных системах (Дополнительные методы). H2 несколько восстанавливает ONOO– (рис. 4d), но не восстанавливает H2O2, NO и O2۰ (рис. 4e – g). В бесклеточных экспериментах мы исследовали, восстанавливает ли H2 окисленные формы биомолекул, участвующих в метаболических окислительно-восстановительных реакциях. При комнатной температуре и нейтральном pH растворы, насыщенные H2, не восстанавливали окисленную форму никотинамидадениндинуклеотида (NAD +), окисленную форму флавинадениндинуклеотида (FAD) или окисленную форму цитохрома C (данные не показаны). Таким образом, мы делаем вывод, что H2 не влияет на метаболизм, участвующий в окислительно-восстановительных реакциях для поддержания  уровней O2۰, H2O и NO, которые играют важную роль в передаче сигнала.

H2 защищает нейроны от ишемии и реперфузии in vitro

Мы также вызвали окислительный стресс в первичной культуре неокортикальных клеток19 в более физиологических условиях. Известно, что быстрый переход от ишемического состояния к реперфузии приводит к повреждению через  окислительный стресс20. Чтобы имитировать ишемию, мы подвергали неокортические клетки кислородно-глюкозной депривации (OGD) в атмосфере азота или водорода в течение 60 минут с последующей реперфузией в среде, содержащей O2 и глюкозу.

Флуоресценция HPF показала, что через 10 минут после завершения OGD с последующей реперфузией, уровни OH заметно увеличивались, когда H2 отсутствовал, и уменьшались, когда присутствовал H2 (дополнительный рисунок). Через 24 часа после OGD и реперфузии H2 увеличивает выживаемость и жизнеспособность нейронов (дополнительный рис. 4), указывая на то, что H2 защищает нейроны от гибели, вызванной окислительным стрессом.

Вдыхание газа H2 защищает мозг при ЧМТ от реперфузии.

Чтобы изучить применимость H2 в качестве антиоксиданта, мы использовали модель ишемии на крысах. АФК образуются во время церебральных ишемии и реперфузии, и являются одной из основных причин повреждения головного мозга 21,22. Мы вызвали очаговую ишемию у крыс путем окклюзии средней мозговой артерии (СМА) на 90 минут, а затем выполнили реперфузию в течении 30 минут (ссылка 23). В трех из четырех случаях крысы вдыхали газ H2, смешанный с закисью азота (N2O) для анестезии, в течение всего 120-минутного процесса (пропорции H2, O2 и N2O (объем / объем / объем) составляли 1%: 30%: 69 %, 2%: 30%: 68% и 4%: 30%: 66%); в четвертом случае H2 отсутствовал (H2: O2: N2O (объем / объем / объем) составлял 0%: 30%: 70%). Мы тщательно отслеживали физиологические параметры во время экспериментов (Методы) и не обнаружили никаких значительных изменений в результате вдыхания H2 (дополнительная таблица 1). Кроме того, не было обнаружено значительного влияния на церебральный кровоток, что измерено с помощью доплер-сканирования (ссылка 24 и дополнительный рис. 5). Н2, растворенный в артериальной крови, увеличивался при вдыхании Н2 пропорционально вдыхаемой концентрации; количество H2, растворенного в венозной крови, было меньше, чем в артериальной крови, что позволяет предположить, что H2 был адсорбирован в тканях (рис. 5a).

Через 1 день после окклюзии СМА мы делали срезы и окрашивали мозг 2,3,5-трифенилтетразолийхлоридом (ТТС) — субстратом для митохондриального дыхания (рис. 5b). Мы оценили площади инфаркта мозга, оценивая окрашивание областей мозга (белый цвет указывает на инфаркт, рис. 5b, c), и обнаружили явное Н2-зависимое уменьшение площади инфаркта, при этом 2–4% Н2 обеспечивает наиболее существенный эффект (рис. 5в). Мы также отметили, что H2 проявляет свой эффект только при вдыхании во время реперфузии; при вдыхании H2 во время ишемии площадь инфаркта существенно не уменьшилась (рис. 5d, e). Для сравнения мы протестировали два других соединения: эдаравон (одобренный в Японии в качестве поглотителя АФК для лечения инфаркта мозга25) и FK506 (в клинических испытаниях инфаркта мозга в США26). H2 был более эффективен, чем эдаравон, и так же эффективен, как FK506, в снижении окислительного повреждения (рис. 5c). Эти результаты указывают на потенциал применения H2 в терапии.

Вдыхание газа H2 подавляет развитие повреждений

Через 1 неделю после окклюзии СМА разница в площади инфаркта между необработанными и обработанными H2 крысами увеличилась по сравнению с 1 днем ​​после окклюзии (рис. 6а, б). Поведение каждой крысы, оцененное по неврологическоq шкале27, показало, что вдыхание H2 во время ишемии и реперфузии улучшало движение (рис. 6c). Более того, масса тела и температура тела крыс, не получавших H2, постепенно снижались, а у крыс, получавших H2, в конечном итоге восстанавливались (рис. 6d, e). Таким образом, H2 подавлял не только первоначальное повреждение мозга, но и его прогрессирующее повреждение.

Мы исследовали H2-опосредованные молекулярные изменения через 12 ч, 3 дня или 7 дней после окклюзии, окрашивая срезы мозга антителами к 8-OH-G, чтобы оценить степень окисления нуклеиновых кислот (дополнительный рисунок 6), и с антителами к HNE для оценки перекисного окисления липидов (дополнительный рис. 6). Для обоих этих окислительных маркеров окрашивание было существенно менее ярким у крыс, получавших H2, по сравнению с крысами, не получавшими H2. Мы также окрашивали идентичные области мозга антителами к Iba1 (ссылка 28) и антителами к GFAP, которые специфичны для активированной микроглии и астроцитов, соответственно (рис. 6f, g и дополнительный рис. 6). Мы обнаружили отчетливое Н2-зависимое уменьшение накопления красителя в микроглии, что свидетельствует о воспалении и ремоделировании. Эти результаты показывают, что H2 может заметно снизить окислительный стресс и подавить тяжесть течения травмы головного мозга.

ОБСУЖДЕНИЕ

Это исследование показывает, что молекулярный водород может избирательно снижать АФК in vitro. Поскольку ۰OH и ONOO– гораздо более реактивны, чем другие ROS (ссылка 14), очевидно, что H2 будет реагировать только с самыми сильными окислителями. Это выгодно для медицинского применения, так как означает, что использование H2 не должно иметь серьезных нежелательных побочных эффектов.

Вероятно, что H2 достаточно мягкий антиоксидант, чтобы не нарушать метаболические реакции восстановления окисления или нарушать АФК, участвующие в передаче сигналов в клетках, в отличии от некоторых антиоксидантных агентов с сильной восстановительной реактивностью, которые увеличивают смертность, возможно, за счет воздействия на основные защитные механизмы29.

H2 имеет ряд преимуществ как потенциальный антиоксидант: он эффективно нейтрализует ОН в живых клетках и, в отличие от большинства известных антиоксидантов, которые не могут успешно воздействовать на органеллы30, он имеет благоприятные характеристики распределения: может проникать через биомембраны и диффундировать в цитозоль, митохондрии и ядро. Несмотря на умеренную восстановительную активность H2, его быстрая газовая диффузия может сделать его высокоэффективным для снижения действия цитотоксических радикалов. Его способность защищать ядерную ДНК и митохондрии предполагает, что он может снизить риск заболеваний и рака, возникновение которых связано с образом жизни. H2 заметно снижает окислительный стресс и подавляет повреждение головного мозга, вызванное ишемией и реперфузией. Вдыхание газа H2 было более эффективным, чем одобренное в настоящее время лечение инфаркта головного мозга, и, кроме того, снижало степень повреждения печени, вызванное ишемией и реперфузией (K. Fukuda, S.A., M.I., Y. Yamamoto, I.O. and S.O., неопубликованные данные). Это открытие указывает на то, что положительные эффекты H2 не специфичны только для церебрального повреждения, но могут быть использованы и для терапии повреждений других органов. Это исследование предполагает, что H2 защищает клетки и ткани от сильного окислительного стресса, поглощая ۰OH. Однако, по-прежнему возможно, что H2 также защищает от стресса, прямо или косвенно уменьшая количество других сильных окислителей в живых клетках. Например, H2 может индуцировать цитопротекторные факторы; однако мы не обнаружили изменений в экспрессии некоторых генов, участвующих в цитопротекции или восстановлении при индуцированнии процесса H2 (K.N., M.I., I.O. and S.O., неопубликованные данные). Дальнейшие исследования выявят механизмы, с помощью которых H2 защищает клетки и ткани от окислительного стресса. Острый окислительный стресс может быть вызван несколькими факторами, в том числе: воспалением, интенсивными упражнениями, инфарктом миокарда, остановкой кровообращения и трансплантацией органов. Для лечения удобно использовать введение Н2 внутрисосудистым путем, растворенный в физиологическом растворе. Для профилактики — питье насыщенной H2 воды. Вдыхание H2 уже использовалось для профилактики декомпрессионной болезни у дайверов и показало хороший уровень безопасности 31. Примечательно, что H2 не имеет риска воспламенения или взрыва при концентрации в воздухе менее 4,7%. Мы предполагаем, что H2, одна из самых известных молекул, может широко использоваться в медицинских целях в качестве безопасного и эффективного антиоксиданта с минимальными побочными эффектами.

МЕТОДЫ

Измерения водорода и кислорода. Мы измерили растворенный в растворе молекулярный водород (H2) и кислород (дикислород, O2), используя водородный электрод (ABLE) и кислородный электрод (Strathkelvin Instruments) соответственно. Мы определяли концентрацию газообразного водорода методом газовой хроматографии (Teramecs). Для измерения уровня H2 в крови мы предварительно обработали крыс гепарином, чтобы избежать свертывания крови, собрали артериальную и венозную кровь (по 5 мл каждая) в пробирки, а затем сразу же ввели образцы крови в закрытые алюминиевые пакеты, содержащие 30 мл воздуха. После полного диффундирования H2 из крови в воздух в закрытом мешке, мы взяли 20 мл воздуха для газовой хроматографии с использованием стандартного газа H2, чтобы количественно определить количество H2.

Водородная обработка культивируемых клеток. В течение 2-часового периода мы растворили H2 сверх уровней насыщения в среде DMEM под давлением 0,4 МПа. Мы растворили O2 во второй среде, барботируя газообразный O2 на уровне насыщения (42,5 мг/л), и CO2 в третью среду, барботируя газ CO2. Все три среды поддерживали при атмосферном давлении. Затем мы объединили три среды (среда H2: среда O2: среда CO2) в пропорции 75%: 20%: 5% (об. / об. / об.) и добавили фетальную телячью сыворотку (FBS) для достижения конечной концентрации 1%. Для культивирования мы поместили объединенную среду в колбу и сразу же проверили концентрацию H2 или O2 с помощью электрода H2 или O2. Затем мы заполнили колбу для культивирования смешанным газом, состоящим из 75% H2, 20% O2 и 5% CO2 (об. / об. / об.), и культивировали клетки в закрытой культуральной колбе. Мы приготовили дегазированную среду без H2 путем перемешивания среды, насыщенной H2, в открытом сосуде в течение 4 ч и проверили концентрацию H2 с помощью водородного электрода. В экспериментах по дозовой зависимости H2 (результаты показаны на рис. 2е) мы разбавляли комбинированную среду четвертой средой, содержащей 1% FBS, уравновешенной воздухом, содержащим 5% CO2, чтобы получить желаемую концентрацию Н2; Затем мы заполнили колбы с культурой смешанным газом, разбавленным воздухом, содержащим 5% CO2.

Индукция окислительного стресса антимицином А и менадионом. Мы поддерживали клетки PC12 при 37 ° C в среде DMEM, содержащей 1% FBS с или без 0,6 мМ H2 в закрытой колбе, заполненной газовой смесью, как описано выше. Мы обрабатывали клетки менадионом или антимицином A, которые ингибируют комплекс I или комплекс III, соответственно, митохондриальной цепи переноса электронов и, таким образом, производят O2۰ (за счет ускорения утечки электронов). После воздействия антимицина А в течение 24 часов мы оценили выживаемость клеток путем ручного подсчета клеток, дважды окрашенных 1 мМ пропидия иодидом (мертвые клетки, помеченные розовым) и 5 ​​мМ Hoechst 33342 (мертвые и живые клетки, помеченные синим) под флуоресцентным микроскопом. Для изучения защитного действия H2 на митохондрии мы предварительно обрабатывали клетки 4,5 г/л 2-дезокси-D-глюкозы (ингибитор гликолиза) и 1 мМ пирувата (субстрат окислительного фосфорилирования) в течение 30 мин, потом подвергали их воздействию антимицина A с 0,6 мМ H2 или без него, а затем количественно определяли уровни клеточного АТФ с использованием набора для измерения клеточного АТФ (TOYO B-Net.).

 

Модель инфаркта головного мозга. Протоколы для животных были одобрены Комитетом по уходу за животными и их использованию медицинской школы Nippon. Мы анестезировали самцов крыс Sprague-Dawley (масса тела: 250–300 г) галотаном (4% для индукции, 1% для поддержания) в смеси закиси азота и кислорода (70%: 30%, об. / об.). Мы поддерживали температуру (37,5 ± 0,5 1С) с помощью термо-одеяла, подключенного к датчику термометра в прямой кишке, и в то же время контролировали физиологические параметры (с помощью канюли в хвостовой артерии), включая: газы крови (pCO2 и pO2), pH, уровень глюкозы и артериальное давление. Мы попытались поддерживать постоянные уровни pH и pO2, регулируя количество галотана и соотношение N2O: O2. Мы воспроизвели фокальную ишемию, выполнив внутрипросветную окклюзию левой средней мозговой артерии (ЛСМA), используя нейлоновую мононить с закругленным кончиком и дистальный цилиндр из силиконового каучука, как описано ранее23. Крысам выполняли окклюзию СМА в течении 90 мин, а затем реперфузию в течении 30 мин; они вдыхали газ H2 в течение всего процесса, за исключением экспериментов, соответствующих рис. 5d, e. Мы лечили крыс эдаравоном и FK506, используя наиболее эффективные концентрации (ссылки 25, 23 и рис. 5c). После того, как крысы оправились от анестезии, их поддерживали при температуре  23 °C.

Через 24 часа после окклюзии СМА мы удалили мозг под анестезией и разрезали его на шесть последовательных коронарных срезов (толщиной 2 мм). Мы окрашивали срезы хлоридом 2,3,5-трифенилтетразолия (TTC) (3%), а затем измеряли области инфаркта и мозговой ткани с помощью системы анализа изображений оптического диссектора (Mac SCOPE, Mitsuya Shoji). Мы очертили границу между инфарктом и тканями, не пораженными инфарктом, и получили площадь инфаркта, вычтя неповрежденную площадь ипсилатерального полушария из контралатеральной стороны. Мы рассчитывали объем инфаркта как толщину зоны инфаркта. Через 12 часов, 3 дня или 7 дней после окклюзии СМА мы быстро удалили мозг под анестезией и зафиксировали его 10% формалином. Мы нарезали залитый парафином мозг на серию 6-мм срезов и окрашивали срезы гематоксилином и эозином (H&E). Затем мы количественно оценили розовые области с помощью системы графического анализатора (Mac Scope). Для иммуноокрашивания мы окрашивали срезы антителами с использованием реагентов VECTASTAIN ABC в соответствии с инструкциями поставщика.

Статистический анализ. Для статистического анализа мы использовали программное обеспечение StatView (SAS Institute). Для единичных сравнений мы выполнили непарный двусторонний t-критерий Стьюдента; для множественных сравнений мы использовали дисперсионный анализ (ANOVA) с последующим точным критерием Фишера. Мы провели эксперименты для количественной оценки слепым способом.

Примечание: дополнительная информация доступна на веб-сайте Nature Medicine.

БЛАГОДАРНОСТИ

Работа поддержана грантами С.О. от Министерства здравоохранения, труда и социального обеспечения (H17-Chouju-009, наука о долголетии; и 17A-10, нервные и психические расстройства) и Министерства образования, культуры, спорта и науки и технологии (16390257).

ВЗНОС АВТОРА

ТАК задумал эксперименты. С.О., И.О., К.К. и Ю.К. разработал эксперименты. I.O., S.A. и S.O. проведен анализ данных. I.O., M.I., K.T., M.W., K.N, K.Y., S.A. и S.O. проводили эксперименты. ТАК. и И. написали статью.

ЗАЯВЛЕНИЕ ОБ ИНТЕРЕСАХ

Авторы заявляют об отсутствии конкурирующих финансовых интересов.

Опубликовано на сайте http://www.nature.com/naturemedicine

Ссылки:

  1. Wallace, C. A mitochondrial paradigm of metabolic and degenerative diseases, aging, and cancer: a dawn for evolutionary medicine. Annu. Rev. Genet. 39, 359–407 (2005).
  2. Reddy, H. Amyloid precursor protein-mediated free radicals and oxidative damage: implications for the development and progression of Alzheimer’s disease. J. Neuro- chem. 96, 1–13 (2006).
  3. Ohta, S. A multi-functional organelle mitochondrion is involved in cell death, prolif- eration and disease. Med. Chem. 10, 2485–2494 (2003).
  4. Wright, , Jr., Scism-Bacon, J.L. & Glass, L.C. Oxidative stress in type 2 diabetes: the role of fasting and postprandial glycaemia. Int. J. Clin. Pract. 60, 308–314 (2006).
  5. Winterbourn, C.C. Biological reactivity and biomarkers of the neutrophil oxidant, hypochlorous acid. Toxicology 181, 223–227 (2002).
  6. Chinopoulos, C. & Adam-Vizi, Calcium, mitochondria and oxidative stress in neuronal pathology. Novel aspects of an enduring theme. FEBS J. 273, 433–450 (2006).
  7. Sauer, , Wartenberg, M. & Hescheler, J. Reactive oxygen species as intracellular messengers during cell growth and differentiation. Cell. Physiol. Biochem. 11, 173–186 (2001).
  8. Turrens, F. Mitochondrial formation of reactive oxygen species. J. Physiol. (Lond.) 552, 335–344 (2003).
  9. Sheu, S., Nauduri, D. & Anders, M.W. Targeting antioxidants to mitochondria: a new therapeutic direction. Biochim. Biophys. Acta 1762, 256–265 (2006).
  10. Liu, , Colavitti, R., Rovira, I.I. & Finkel, T. Redox-dependent transcriptional regula- tion. Circ. Res. 97, 967–974 (2005).
  11. Murad, Discovery of some of the biological effects of nitric oxide and its role in cell signaling. Biosci. Rep. 24, 452–474 (2004).
  12. Buxton, V., Greenstock, C.L., Helman, W.P. & Ross, A.B. Critical review of rate constants for reactions of hydrated electrons, hydrogen atoms and hydroxyl radicals ( OH/ O) in aqueous solution. J. Phys. Chem. Ref. Data 17, 513–886 (1988).
  13. Ohsawa, I., Nishimaki, K., Yasuda, , Kamino, K. & Ohta, S. Deficiency in a mitochondrial aldehyde dehydrogenase increases vulnerability to oxidative stress in PC12 cells. J. Neurochem. 84, 1110–1117 (2003).
  14. Setsukinai, K., Urano, , Kakinuma, K., Majima, H.J. & Nagano, T. Development of novel fluorescence probes that can reliably detect reactive oxygen species and distinguish specific species. J. Biol. Chem. 278, 3170–3175 (2003).
  15. Tomizawa, et al. The detection and quantification of highly reactive oxygen species using the novel HPF fluorescence probe in a rat model of focal cerebral ischemia. Neurosci. Res. 53, 304–313 (2005).
  16. Kamiya, Mutagenicities of 8-hydroxyguanine and 2-hydroxyadenine produced by reactive oxygen species. Biol. Pharm. Bull. 27, 475–479 (2004).
  17. Petersen, R. & Doorn, J.A. Reactions of 4-hydroxynonenal with proteins and cellular targets. Free Radic. Biol. Med. 37, 937–945 (2004).
  18. Falick, M., Mahan, B.H. & Myers, R.J. Paramagnetic resonance spectrum of the 1Dg oxygen molecule. J. Chem. Phys. 42, 1837–1838 (1965).
  19. Asoh, et al. Protection against ischemic brain injury by protein therapeutics. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 99, 17107–17112 (2002).
  20. Halestrap, P. Calcium, mitochondria and reperfusion injury: a pore way to die. Biochem. Soc. Trans. 34, 232–237 (2006).
  21. Lipton, Ischemic cell death in brain neurons. Physiol. Rev. 79, 1431–1568 (1999).
  22. Ferrari, et al. Oxidative stress during myocardial ischaemia and heart failure. Curr. Pharm. Des. 10, 1699–1711 (2004).
  23. Nito, , Kamiya, T., Ueda, M., Arii, T. & Katayama, Y. Mild hypothermia enhances the neuroprotective effects of FK506 and expands its therapeutic window following transient focal ischemia in rats. Brain Res. 1008, 179–185 (2004).
  24. Takada, et al. Adenovirus-mediated gene transfer to ischemic brain is augmented in aged rats. Exp. Gerontol. 38, 423–429 (2003).
  25. Zhang, N. et al. Edaravone reduces early accumulation of oxidative products and sequential inflammatory responses after transient focal ischemia in mice Stroke 36, 2220–2225 (2005).
  26. Labiche, L.A. & Grotta, J.C. Clinical trials for cytoprotection in stroke. NeuroRx 1, 46–70 (2004).
  27. Murakami, K. et al. Mitochondrial susceptibility to oxidative stress exacerbates cerebral infarction that follows permanent focal cerebral ischemia in mutant mice with manganese superoxide dismutase J. Neurosci. 18, 205–213 (1998).
  28. Ito, D. et al. Microglia-specific localisation of a novel calcium binding protein, Brain Res. Mol. Brain Res. 57, 1–9 (1998).
  29. Bjelakovic, G., Nikolova, D., Gluud,  L., Simonetti, R.G. &  Gluud, C. Mortality  in randomized trials of antioxidant supplements for primary and secondary pre- vention: systematic review and meta-analysis. J. Am. Med. Assoc. 297, 842–857 (2007).
  30. James, M., Cocheme, H.M. & Murphy, M.P. Mitochondria-targeted redox probes as tools in the study of oxidative damage and ageing. Mech. Ageing Dev. 126, 982–986 (2005).
  31. Fontanari, et al. Changes in maximal performance of inspiratory and skeletal muscles during and after the 7.1-MPa Hydra 10 record human dive. Eur. J. Appl. Physiol. 81, 325–328 (2000).
Комментарии
Отзывов еще никто не оставлял
Обратный звонок
Запрос успешно отправлен!
Имя *
Телефон *
Предзаказ
Предзаказ успешно отправлен!
Имя *
Телефон *
Добавить в корзину
Перейти в корзину
Заказ в один клик